DNA dan gen: struktur DNA, replikasi, transkripsi dan translasi, genom bakteri dan plasmid, serta mengapa informasi genetik menentukan sifat mikroba

Dua juru masak dan seorang pramusaji instalasi gizi sebuah rumah sakit diare sehari setelah makan siang bersama, lalu laboratorium melaporkan Escherichia coli dari sisa salad dengan catatan "gen toksin LT dan ST terdeteksi" (kasus rekaan untuk latihan). Kepala dapur heran: E. coli ada di usus setiap orang, jadi mengapa laporan ini serius, dan mengapa laboratorium memeriksa DNA-nya? Menurut OpenStax, E. coli enterotoksigenik (ETEC) berbeda dari E. coli biasa karena membawa gen faktor virulensi pada plasmid: toksin LT dan ST yang membuat sel usus mengeluarkan ion klorida dan air, serta faktor kolonisasi yang membantu bakteri menempel di usus halus. Uji urutan DNA penyandi faktor itu membedakan galur berbahaya dari galur biasa bernama sama. Bab ini menjelaskan DNA dan gen, cara sel menyalin dan membacanya, dan mengapa dua bakteri bernama sama dapat berperilaku sangat berbeda.

Batas pembahasan

Bab ini membahas struktur DNA dan RNA, replikasi, transkripsi, translasi, genom bakteri dan plasmid, serta genotipe dan fenotipe. Sel dan pertumbuhan mikroba dibahas di Bab 1 tentang mikroba dan kontaminasi. Mutasi, pertukaran gen, dan operon dibahas di Bab 30 tentang mutasi dan pertukaran gen, rekayasa genetika di Bab 31 tentang DNA rekombinan dan CRISPR, dan PCR serta sekuensing di Bab 32 tentang uji molekuler. Endospora dibahas di Bab 2 tentang jenis mikroba, biofilm di Bab 5 tentang biofilm di pipa dan mesin, toksin dan faktor virulensi di Bab 23 tentang cara mikroba membuat sakit, dan genom virus di Bab 18 tentang virus dan prion.

Sumber utamanya OpenStax Microbiology subbab 10.2 sampai 10.4 dan 11.1 sampai 11.4, ditambah OpenStax Biology 2e subbab 14.2. Sumber setiap klaim, angka latihan, dan penalaran editorial dicatat di peta sumber bab. Teknisi tidak menangani biakan atau sampel DNA; bab ini memberi dasar untuk membaca laporan laboratorium.

Nukleotida, pasangan basa, dan heliks ganda

Asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid, DNA) adalah asam nukleat yang urutan basanya membawa dan menyimpan informasi turun-temurun sel. Nukleotida (nucleotide) adalah satuan penyusun asam nukleat yang terdiri atas gula berkarbon lima, gugus fosfat, dan basa nitrogen; pada DNA gulanya deoksiribosa. Basanya adenin (A) dan guanin (G), yang tergolong purin bercincin dua, serta sitosin (C) dan timin (T), yang tergolong pirimidin bercincin satu.

Nukleotida disambung oleh ikatan fosfodiester antara fosfat pada karbon 5' satu gula dan gugus hidroksil pada karbon 3' gula berikutnya, membentuk tulang punggung gula-fosfat. Karena itu setiap untai punya arah: ujung 5' dengan fosfat bebas dan ujung 3' dengan hidroksil bebas.

Erwin Chargaff menemukan bahwa kadar adenin hampir sama dengan timin dan kadar guanin hampir sama dengan sitosin. James Watson dan Francis Crick memakai aturan itu serta citra difraksi sinar-X dari Rosalind Franklin, R.G. Gosling, dan Maurice Wilkins untuk menyusun model heliks ganda pada 1953.

Pasangan basa komplementer (complementary base pair) adalah pasangan purin dan pirimidin dari dua untai DNA yang berhadapan, yaitu A dengan T dan G dengan C. A dan T diikat dua ikatan hidrogen, sedangkan G dan C diikat tiga ikatan hidrogen. Kedua untai bersifat antiparalel: ujung 3' satu untai berhadapan dengan ujung 5' untai lainnya, dengan tulang punggung di luar dan basa bertumpuk di dalam seperti anak tangga. Menurut Biology 2e, jarak antarpasangan basa 0,34 nm, satu putaran heliks 3,4 nm sehingga berisi 10 pasangan basa, dan diameter heliks seragam 2 nm.

Panjang DNA terentang dapat ditaksir dari jumlah pasangan basanya (penalaran editorial dari angka Biology 2e):

$L = N \times 0{,}34\ \text{nm}, \qquad n_{\text{putaran}} = \frac{N}{10}$

dengan $L$ panjang DNA (nm), $N$ jumlah pasangan basa, dan $n_{\text{putaran}}$ jumlah putaran heliks (Contoh 3).

Denaturasi DNA (DNA denaturation) adalah pemisahan heliks ganda menjadi dua untai tunggal karena putusnya ikatan hidrogen antarbasa oleh panas atau bahan kimia tertentu. Pendinginan membuat untai menyatu kembali, dan DNA berkadar GC tinggi lebih sulit didenaturasi karena pasangan G-C punya satu ikatan hidrogen lebih banyak. Pemisahan dan penyatuan untai ini menjadi dasar beberapa teknik bioteknologi; PCR di Bab 32 memakainya.

RNA, gen, dan dogma sentral

Gen (gene) adalah ruas DNA yang memuat kode untuk membuat protein, enzim, atau molekul RNA stabil. Genom (genome) adalah seluruh DNA di dalam sel, yang tersusun atas gen pada kromosom dan plasmid. DNA menjadi bahan warisan yang disalin teliti ke sel anak sekaligus petunjuk untuk membuat protein. Aliran informasi dari DNA ke RNA lalu ke protein disebut dogma sentral, sedangkan transkripsi dan translasi bersama disebut ekspresi gen.

Asam ribonukleat (ribonucleic acid, RNA) adalah asam nukleat yang umumnya beruntai tunggal, bergula ribosa, dan memakai basa urasil (U) sebagai pengganti timin. DNA lebih stabil untuk menyimpan informasi, sedangkan RNA yang kurang stabil cocok untuk tugas jangka pendek. Tiga jenis RNA bekerja langsung dalam pembuatan protein:

Dua subbab OpenStax menyebut rRNA sekitar 50 dan sampai 60 persen massa ribosom. Pada prokariot mRNA biasanya bertahan tidak lebih dari 5 detik, sedangkan mRNA eukariot dapat bertahan beberapa jam. Banyak virus memakai RNA sebagai bahan genetiknya, seperti di Bab 18.

Replikasi DNA pada bakteri

Replikasi semikonservatif (semiconservative replication) adalah cara penyalinan DNA dengan memisahkan kedua untai heliks dan memakai masing-masing sebagai cetakan, sehingga setiap DNA hasil salinan berisi satu untai lama dan satu untai baru. Matthew Meselson dan Franklin Stahl membuktikannya pada 1958 dengan menumbuhkan E. coli di media berisi nitrogen berat ${}^{15}$N lalu memindahkannya ke ${}^{14}$N. Setelah satu generasi ada satu pita DNA di posisi tengah, dan setelah dua generasi dua pita, di tengah dan di posisi ringan.

E. coli punya satu kromosom melingkar sepanjang 4,6 juta pasangan basa (Mbp) yang disalin dalam sekitar 42 menit dari satu titik asal ke dua arah, dengan penambahan sekitar 1.000 nukleotida per detik. Titik asal replikasi E. coli, oriC, panjangnya sekitar 245 pasangan basa dan kaya pasangan A-T, yang ikatannya lebih lemah sehingga lebih mudah dibuka. Urutan kerjanya:

Karena polimerase hanya bekerja ke arah 5' ke 3', satu untai baru dibangun terus-menerus menuju garpu (untai pemimpin), sedangkan untai lainnya dibangun sepotong-sepotong menjauhi garpu, masing-masing dimulai primer baru (untai tertinggal). Potongan itu disebut fragmen Okazaki. DNA girase dan topoisomerase IV bakteri berbeda dari padanannya pada eukariot, sehingga keduanya menjadi sasaran golongan obat kuinolon. Kebutuhan polimerase akan ujung 3'-OH juga dasar sekuensing Sanger di Bab 32.

Sebagai pembanding, genom manusia berisi 3 miliar pasangan basa per set kromosom haploid, punya 30.000 sampai 50.000 titik asal, dan disalin sekitar 100 nukleotida per detik. Sebagian plasmid disalin dengan replikasi lingkaran bergulir: satu untai dipotong, ujung 3'-OH-nya dipanjangkan sambil menggeser untai lama, lalu untai yang tergeser dilengkapi menjadi untai ganda. Cara ini muncul lagi pada konjugasi di Bab 30.

Transkripsi: dari gen ke mRNA

Transkripsi (transcription) adalah penyalinan informasi dari urutan DNA satu gen atau lebih menjadi untai RNA. Satu untai DNA menjadi cetakan, disebut untai antisens. RNA yang dihasilkan komplementer terhadap cetakan dan hampir sama dengan untai pasangannya (untai sens); bedanya, setiap T diganti U. Berbeda dari DNA polimerase, RNA polimerase tidak memerlukan primer.

Bakteri memakai satu jenis RNA polimerase untuk semua gennya; pada E. coli lima subunit membentuk enzim inti, dan subunit keenam, faktor sigma (σ), membuat enzim menempel pada promotor tertentu. Promotor (promoter) adalah urutan DNA tempat perangkat transkripsi menempel dan memulai transkripsi. Promotor bakteri punya dua urutan yang mirip antarbakteri, pada posisi -10 (TATAAT) dan -35 (dikenali σ) sebelum titik awal transkripsi. Setelah σ lepas, enzim inti memanjangkan RNA ke arah 5' ke 3' dengan laju sekitar 40 nukleotida per detik, lalu berhenti dan lepas pada urutan berulang yang menjadi sinyal terminasi.

mRNA bakteri sering polisistronik, yaitu memuat beberapa polipeptida sekaligus dari gen-gen bersebelahan di bawah satu promotor; susunan ini disebut operon dan pengaturannya dibahas di Bab 30. Eukariot memakai tiga RNA polimerase, menambahkan tudung 5' dan ekor poli-A sekitar 200 adenin, serta membuang intron lewat penyambungan; bakteri tidak melakukan ketiganya.

Translasi dan kode genetik

Kodon (codon) adalah urutan tiga nukleotida pada mRNA yang menentukan satu asam amino atau sinyal berhenti. Protein disusun dari 20 asam amino yang lazim. Empat basa pada tiga posisi memberi 64 kombinasi; 61 menyandi asam amino dan 3 adalah kodon berhenti, yaitu UAA, UAG, dan UGA. Kodon AUG menyandi metionin dan biasanya menjadi kodon mulai yang menetapkan bingkai baca. Karena 61 kodon berbagi 20 asam amino, satu asam amino dapat disandi lebih dari satu kodon; posisi ketiga kodon (posisi goyang) paling sedikit menentukan. Kode genetik hampir universal untuk semua makhluk, dengan beberapa pengecualian seperti selenosistein dan pirolisin pada arkea dan bakteri.

Ribosom (ribosome) adalah gabungan rRNA dan banyak polipeptida yang membaca mRNA dan menyambung asam amino menjadi protein. Prokariot punya ribosom 70S (subunit 30S dan 50S), sedangkan sitoplasma eukariot punya ribosom 80S; mitokondria dan kloroplas punya ribosom 70S. Perbedaan 70S dan 80S membuat pembuatan protein menjadi sasaran yang baik bagi obat antibakteri. Bakteri biasanya punya 60 sampai 90 jenis tRNA, masing-masing dengan antikodon tiga nukleotida yang berpasangan dengan kodon dan ujung pengikat asam amino.

Pada E. coli, subunit 30S, mRNA, faktor inisiasi, GTP, dan tRNA pembawa N-formil-metionin berkumpul pada kodon AUG; urutan Shine-Dalgarno (AGGAGG) di depannya menambatkan ribosom, lalu subunit 50S bergabung. Tempat A ribosom menerima tRNA bermuatan, tempat P memegang tRNA pembawa rantai polipeptida, dan tempat E melepas tRNA kosong. Perangkat translasi E. coli hanya perlu 0,05 detik per asam amino, sehingga protein 200 asam amino selesai dalam 10 detik, dan translasi berhenti saat kodon berhenti tiba di tempat A.

Pada prokariot, transkripsi dan translasi berlangsung bersamaan di sitoplasma, dan banyak ribosom membaca satu mRNA sekaligus (poliribosom). Menurut OpenStax, inilah yang membuat sel prokariot dapat menanggapi sinyal lingkungan dengan sangat cepat.

Genom bakteri dan plasmid

Kebanyakan prokariot punya satu kromosom melingkar di daerah sitoplasma yang disebut nukleoid, dengan satu salinan setiap gen (haploid). DNA dipadatkan dengan pilinan lebih (supercoiling) dalam beberapa domain dan dibantu protein mirip histon. Prokariot memakai genomnya dengan efisien: rata-rata hanya sekitar 12 persen genom berupa DNA tak menyandi, sedangkan pada manusia sekitar 98 persen. Ukuran genom bakteri beragam:

Bakteri berkemampuan metabolik luas, seperti P. aeruginosa di Bab 14 tentang keragaman bakteri, bergenom besar (Contoh 9).

Plasmid (plasmid) adalah molekul DNA kecil berbentuk lingkaran di luar kromosom prokariot yang membawa satu atau beberapa gen yang tidak mutlak untuk pertumbuhan normal. Plasmid dapat dipertukarkan antarbakteri lewat transfer gen horizontal dan dapat membawa gen faktor virulensi atau gen resistensi antibiotik. Cara pertukarannya ada di Bab 30, dan pemakaiannya dalam rekayasa genetika di Bab 31.

Contoh paling tajam dari OpenStax adalah Bacillus anthracis dan Bacillus cereus, yang genomnya dibandingkan pada 2003: gen 16S rRNA keduanya lebih dari 99 persen identik dan kromosomnya sangat mirip. Perbedaan besarnya ada pada dua plasmid besar milik B. anthracis: pX01 menyandi toksin tiga bagian yang menekan sistem imun, dan pX02 menyandi kapsul yang melindungi bakteri dari sistem imun. B. cereus tidak punya kedua plasmid itu dan, menurut OpenStax, umumnya dikaitkan dengan diare ringan; keracunan pangan oleh B. cereus dibahas di Bab 20. Pada ETEC, OpenStax menafsirkan letak gen toksin di plasmid sebagai tanda bahwa gen itu didapat dari bakteri lain dan dipertahankan lewat transfer gen horizontal.

Genotipe, fenotipe, dan sifat mikroba yang dihadapi teknisi

Genotipe (genotype) adalah seluruh kumpulan gen yang dimiliki sel. Fenotipe (phenotype) adalah kumpulan sifat sel yang dapat diamati dan ditentukan oleh gen yang sedang diekspresikan pada kondisi lingkungan tertentu. Genotipe sel tetap, tetapi sel tidak menyalakan semua gennya bersamaan; gen yang selalu menyala disebut gen konstitutif. Streptococcus mutans di mulut hanya membuat lapisan lendir lengket pembentuk plak gigi bila ada sukrosa. Serratia marcescens, bakteri yang sering dikaitkan dengan infeksi rumah sakit, membuat pigmen merah pada 28 °C tetapi tidak pada 37 °C. Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan dibahas di Bab 16.

Sifat yang paling sering dihadapi teknisi juga program gen:

Tabel disusun dari OpenStax. Penginderaan kuorum (quorum sensing) adalah komunikasi antarsel bakteri lewat molekul pemberi sinyal yang memungkinkan tanggapan bersama ketika populasi mencapai kepadatan ambang. Pada sebagian patogen, faktor virulensi baru dibuat setelah sel cukup banyak untuk mengalahkan pertahanan inang. Uraiannya ada di Bab 2 tentang spora, Bab 5 tentang biofilm, Bab 23 tentang toksin, dan Bab 13 tentang resistensi.

Tiga akibat praktis (penalaran editorial). Nama spesies saja tidak cukup untuk menilai bahaya; laporan yang menyebut gen toksin atau gen resistensi memberi informasi penting. Gula, suhu, kelembapan, dan kepadatan sel ikut menentukan gen yang menyala, sehingga kebersihan, pengeringan, dan pengendalian suhu memengaruhi sifat yang muncul, bukan hanya jumlah bakteri. Uji DNA mendeteksi gen, padahal sel yang mati melepaskan DNA-nya ke lingkungan, sehingga hasil positif tidak otomatis berarti ada bakteri hidup; artinya ditetapkan laboratorium, seperti di Bab 32 tentang uji molekuler.

Contoh kerja

Contoh 1: aturan Chargaff. Soal OpenStax menyebut sampel DNA berisi 22 persen timin. Karena A = T, adenin juga 22 persen. Sisanya $100 - 2 \times 22 = 56$ persen dibagi rata untuk G dan C, sehingga G = C = 28 persen dan kadar GC 56 persen.

Contoh 2: untai pasangan dan ikatan hidrogen. Untai 5'-ATTCCGGATCGA-3' (soal OpenStax) berpasangan dengan 3'-TAAGGCCTAGCT-5', yang ditulis dari ujung 5' menjadi 5'-TCGATCCGGAAT-3'. Untai ini punya 6 pasangan A-T dan 6 pasangan G-C, sehingga ikatan hidrogennya $6 \times 2 + 6 \times 3 = 30$. Ruas 12 pasangan A-T, misalnya 5'-ATTATAATTAAT-3' (angka latihan), hanya punya $12 \times 2 = 24$ ikatan, 20 persen lebih sedikit, sehingga titik asal yang kaya A-T lebih mudah dibuka.

Contoh 3: panjang DNA E. coli. Dengan rumus di atas, $L = 4{,}6 \times 10^{6} \times 0{,}34\ \text{nm} = 1{,}56 \times 10^{6}$ nm, yaitu 1,56 mm, dengan $4{,}6 \times 10^{6}/10 = 460.000$ putaran. Untuk sel sepanjang 2 µm (angka latihan, di dalam rentang ukuran bakteri di Bab 2), DNA itu sekitar $1{,}56 \times 10^{-3}/(2 \times 10^{-6}) = 780$ kali panjang sel. Biology 2e menulis "sekitar 1,1 mm", yang setara hanya 3,2 juta pasangan basa, jadi tidak cocok dengan 0,34 nm per pasangan basa (penalaran editorial). Untuk manusia, 3 miliar pasangan basa memberi 1,02 m; angka "sekitar 2 meter" di Microbiology cocok untuk dua set kromosom, $6 \times 10^{9} \times 0{,}34\ \text{nm} = 2{,}04$ m.

Contoh 4: memeriksa laju replikasi. Kromosom 4,6 Mbp disalin dalam 42 menit atau 2.520 detik, sehingga laju totalnya $4{,}6 \times 10^{6}/2.520 = 1.825$ nukleotida per detik, atau $1.825/2 = 913$ per garpu, sejalan dengan angka OpenStax sekitar 1.000. Dengan laju eukariot 100 nukleotida per detik per garpu, satu titik asal memerlukan $4{,}6 \times 10^{6}/(2 \times 100) = 23.000$ detik, sekitar 383 menit (penalaran editorial).

Contoh 5: percobaan Meselson dan Stahl. Dua untai berat asli tidak pernah hilang, tetapi tersebar ke molekul yang makin banyak. Setelah $n$ generasi di ${}^{14}$N ada $2^{n}$ molekul dan hanya 2 di antaranya hibrida, sehingga fraksi hibrida $2/2^{n}$: 100 persen pada generasi pertama, 50 persen pada generasi kedua, dan 25 persen pada generasi ketiga, dengan 75 persen sisanya DNA ringan (penalaran editorial).

Contoh 6: mengapa kodon tiga basa. Kodon dua basa hanya memberi $4^{2} = 16$ kombinasi, kurang dari 20 asam amino, sedangkan tiga basa memberi $4^{3} = 64$. Dengan 61 kodon untuk 20 asam amino, rata-ratanya $61/20 = 3{,}05$ kodon per asam amino.

Contoh 7: waktu membuat satu protein. Protein 200 asam amino memerlukan $(200 + 1) \times 3 = 603$ nukleotida penyandi, termasuk kodon berhenti. Translasinya $200 \times 0{,}05 = 10$ detik dan transkripsinya pada 40 nukleotida per detik $603/40 = 15{,}1$ detik. Karena ribosom mulai membaca sebelum transkripsi selesai, protein pertama dapat jadi dalam belasan detik (penalaran editorial).

Contoh 8: peluang urutan basa. Bila keempat basa dianggap sama sering dan acak (anggapan penyederhana), peluang urutan 6 basa tertentu, misalnya TATAAT, pada satu posisi adalah $(1/4)^{6} = 1/4.096$. Pada kromosom 4,6 Mbp harapannya $4{,}6 \times 10^{6}/4.096 = 1.123$ kali per untai, atau 2.246 kali pada kedua untai. Urutan 12 basa punya harapan $2 \times 4{,}6 \times 10^{6}/4^{12} = 0{,}55$ kali, sehingga urutan sepanjang itu cenderung khas; prinsip ini dipakai untuk mengenali gen di Bab 32 (penalaran editorial).

Contoh 9: ukuran genom dan jumlah gen. Genom P. aeruginosa $6{,}3/0{,}58 = 10{,}9$ kali genom M. genitalium. Dengan 88 persen bagian menyandi dan anggapan satu gen sekitar 1.000 pasangan basa (angka latihan), P. aeruginosa punya sekitar $6{,}3 \times 10^{6} \times 0{,}88/1.000 = 5.544$ gen dan M. genitalium sekitar 510. Taksiran kasar ini sejalan dengan luasnya kemampuan metabolik P. aeruginosa.

Kondisi berhenti

Hentikan dan serahkan kepada laboratorium, dokter, atau tim pencegahan dan pengendalian infeksi (PPI) bila:

1. Teknisi diminta menyimpulkan seseorang sakit, sembuh, atau aman bekerja dari laporan uji DNA atau biakan; penilaian itu wewenang dokter dan laboratorium.
2. Laporan uji pangan, air, atau permukaan menyebut gen toksin atau gen resistensi; hentikan pemakaian bahan atau titik itu menurut prosedur fasilitas dan laporkan ke penanggung jawab keamanan pangan atau tim PPI.
3. Teknisi diminta membuka, memindahkan, atau membuang biakan, sampel klinis, atau reagen laboratorium; pewarna DNA laboratorium seperti etidium bromida berpotensi mutagen.
4. Ada usul mengurangi prosedur pembersihan karena "bakterinya cuma E. coli biasa" tanpa hasil laboratorium yang mendukung.
5. Hasil uji DNA tidak mencantumkan metode, sasaran gen, dan batas deteksi; minta penjelasan laboratorium sebelum dipakai.

Salah tafsir yang sering terjadi

1. "E. coli ya E. coli, semuanya sama." Galur dengan plasmid toksin seperti ETEC berbeda sifat dari galur biasa, walaupun nama spesiesnya sama.
2. "Kalau bakteri punya gennya, sifatnya pasti muncul." Fenotipe bergantung pada gen yang sedang menyala; Serratia marcescens yang bergen pigmen tidak berwarna merah pada 37 °C.
3. "Uji DNA positif berarti ada bakteri hidup." Uji DNA mendeteksi gen, dan DNA dapat tertinggal dari sel yang sudah mati; arti hasilnya ditetapkan laboratorium.
4. "Makin besar genom, makin berbahaya bakterinya." Banyak patogen intraseluler justru bergenom kecil; ukuran genom lebih mencerminkan keragaman kemampuan metabolik.
5. "Hanya virus yang punya RNA." Semua sel memakai mRNA, rRNA, dan tRNA untuk membuat protein; sebagian virus memakai RNA sebagai bahan genetik.

Hubungan dengan bab lain

Bab 1 memberi dasar sel dan pertumbuhan mikroba. Bab 30 melanjutkan dengan mutasi, pertukaran gen, dan operon, Bab 31 memakai plasmid untuk rekayasa genetika, dan Bab 32 memakai denaturasi, primer, dan polimerase untuk PCR. Bab 2 menjelaskan endospora, Bab 5 biofilm, Bab 23 toksin dan faktor virulensi, Bab 13 resistensi terhadap disinfektan dan antibiotik, Bab 18 genom virus, dan Bab 20 B. cereus serta E. coli pada pangan. Peluang pada Contoh 8 memakai aturan dasar di Bab 10 · Data & Pengukuran.

Latihan dan pembahasan

Referensi