PCR, sekuensing, dan pelacakan wabah: PCR dan qPCR, elektroforesis gel, sekuensing DNA, sekuensing genom utuh untuk wabah pangan, dan batas uji molekuler

Misalkan, dua hari setelah resepsi pernikahan di ballroom sebuah hotel, 23 tamu dan 2 pramusaji diare dan demam. Petugas dinas kesehatan mengambil sampel dari pasien, sisa makanan, dan peralatan dapur. Laporan pertama yang sampai ke manajer berbunyi: usap talenan yang diambil sesudah dibersihkan "PCR positif Salmonella, Ct 37", sedangkan biakan dari usap yang sama tidak tumbuh. Kepala dapur menyimpulkan talenan itu sumber wabah, manajer menyimpulkan pembersihan gagal, dan seorang staf bertanya mengapa satu uji positif sementara uji lain negatif. Dua minggu kemudian laboratorium kesehatan masyarakat melaporkan bahwa genom Salmonella dari enam tamu hampir identik dengan genom dari ayam mentah pemasok, dan juga dengan kasus di kota lain yang membeli dari pemasok yang sama. Bab ini menjelaskan arti hasil-hasil itu dan apa yang tidak dapat disimpulkan darinya.

Batas pembahasan

Bab ini membahas ekstraksi dan pelacak DNA, PCR dan qPCR, elektroforesis gel, sekuensing DNA, sekuensing genom utuh untuk pelacakan wabah pangan, batas uji molekuler, dan cara membaca laporannya. Hitungan cawan, CFU, dan batas deteksi biakan ada di Bab 15 tentang menghitung mikroba, epidemiologi wabah dan pelaporannya di Bab 19 tentang epidemiologi wabah, dan patogen pangan serta cara menjaga bukti di Bab 20 tentang patogen bawaan makanan. Sensitivitas, spesifisitas, dan nilai duga ada di Bab 27 tentang uji diagnostik imunologi, dan peluang bersyarat di Bab 10 · Data & Pengukuran tentang peluang untuk teknisi. Struktur dan replikasi DNA ada di Bab 29 tentang DNA dan gen, enzim restriksi dan kloning di Bab 31 tentang rekayasa genetika, RT-qPCR untuk norovirus di Bab 18 tentang virus, dan reduksi log di Bab 3 tentang kinetika kematian mikroba.

Teknisi tidak mengambil sampel klinis dan tidak menjalankan uji molekuler; keputusan tentang sumber wabah ada pada laboratorium dan dinas kesehatan.

Dari sampel ke DNA: ekstraksi dan pelacak

Ekstraksi asam nukleat memecah sel dengan larutan lisis yang sebagian besar berupa deterjen, menghancurkan protein dan RNA dengan protease dan ribonuklease, lalu mengendapkan DNA dengan alkohol; DNA dapat disimpan beku pada suhu minus 80 °C selama beberapa tahun. RNA jauh kurang stabil karena ribonuklease ada di mana-mana dan sulit dinonaktifkan. Karena itu penanganan dan suhu sampel sampai di laboratorium ikut menentukan hasil uji RNA, dan penanganan itu wewenang petugas pengambil sampel.

Pelacak DNA (DNA probe) adalah potongan DNA untai tunggal yang melengkapi sebagian gen yang dicari. Pelacak diberi penanda radioaktif atau pewarna fluoresen, dan DNA sampel harus dibuat untai tunggal agar pelacak dapat menempel pada urutan yang cocok. Pemakaian langsung pada dahak dan sampel tubuh lain sering bermasalah karena sampelnya kompleks, sehingga DNA biasanya diekstraksi lebih dulu.

PCR: tiga langkah dan penggandaan

Reaksi berantai polimerase (polymerase chain reaction, PCR) adalah teknik di luar sel yang dengan cepat menggandakan jumlah salinan urutan DNA tertentu agar tersedia untuk analisis lain. PCR dikembangkan Kary Mullis pada 1983. Enzimnya, polimerase DNA Taq, berasal dari bakteri Thermus aquaticus yang diisolasi dari mata air panas di Taman Nasional Yellowstone, dan tahan suhu tinggi yang dipakai PCR. Primer PCR (PCR primer) adalah potongan DNA pendek buatan yang urutannya melengkapi ujung daerah sasaran, tempat polimerase mulai menyalin.

Satu siklus PCR terdiri atas tiga langkah yang dijalankan otomatis oleh mesin siklus termal:

Setiap siklus menggandakan jumlah salinan sasaran untai ganda, dan protokol biasanya 25 sampai 40 siklus, sehingga satu sasaran dapat menjadi puluhan juta sampai lebih dari satu triliun salinan. PCR bukan metode sekuensing, dan metode penggandaan isotermal tanpa siklus suhu juga sudah dikembangkan.

Penggandaan sempurna adalah keadaan ideal. Bentuk umumnya:

$$N_n = N_0 \,(1+E)^{n}, \qquad n = \frac{\log (N_n/N_0)}{\log (1+E)}$$

dengan $N_0$ jumlah salinan awal, $N_n$ jumlah salinan setelah $n$ siklus, $n$ jumlah siklus (tanpa satuan), dan $E$ efisiensi per siklus (pecahan, 1 berarti tepat dua kali lipat). Contoh 1 dan 2 memakai rumus ini.

RT-PCR, qPCR, dan nilai Ct

RT-PCR (reverse transcriptase PCR) adalah variasi PCR yang dimulai dengan mengubah mRNA menjadi cDNA dengan enzim transkriptase balik, lalu cDNA digandakan dengan PCR biasa. Cara ini dipakai untuk sasaran berupa RNA, termasuk genom virus RNA seperti norovirus yang dibahas di Bab 18 tentang virus.

PCR waktu nyata (real-time PCR, quantitative PCR, qPCR) adalah variasi PCR yang memakai fluoresensi untuk memantau kenaikan DNA untai ganda selama reaksi berlangsung sehingga jumlah sasaran awal dapat ditaksir. PCR biasa tidak kuantitatif karena salah satu pereaksi dapat habis sebelum semua siklus selesai, dan hasilnya hanya dibaca di akhir. qPCR dapat menentukan jumlah salinan DNA, dan kadang jumlah organisme, dalam sampel, dan qRT-PCR dipakai untuk mengukur muatan virus pasien HIV. Uji amplifikasi asam nukleat juga disebut standar emas klinis untuk mendeteksi bahan genetik patogen.

Nilai Ct (cycle threshold) adalah jumlah siklus PCR yang diperlukan sampai bahan genetik sasaran terdeteksi. Menurut artikel jurnal CDC, makin rendah Ct, makin tinggi muatan virus dalam sampel. Dari rumus di atas:

$$\frac{N_{0,A}}{N_{0,B}} = (1+E)^{\,Ct_B - Ct_A}, \qquad E = 10^{-1/s} - 1$$

dengan $N_{0,A}$ dan $N_{0,B}$ jumlah salinan awal sampel A dan B, $Ct_A$ dan $Ct_B$ nilai Ct-nya, dan $s$ kemiringan kurva standar, yaitu garis Ct terhadap $\log_{10}$ jumlah salinan dari seri pengenceran sepuluh kali (tanpa satuan). Pada $E = 1$, selisih 10 kali lipat sama dengan $\log_2 10 \approx 3{,}32$ siklus. Ambang, efisiensi, dan cara ekstraksi berbeda antarlaboratorium dan antarmetode, sehingga angka Ct hanya dibandingkan di dalam satu laboratorium dengan metode yang sama.

Elektroforesis gel dan pola pita

Elektroforesis gel agarosa (agarose gel electrophoresis) adalah cara memisahkan molekul DNA menurut ukurannya dengan perbedaan laju gerak di dalam gel mendatar yang diberi beda tegangan. Tulang punggung DNA bermuatan negatif, sehingga DNA ditarik dari sumur di dekat elektrode negatif menuju elektrode positif; matriks agarosa menghambat molekul besar, sehingga potongan kecil bergerak lebih jauh. Ukuran potongan ditaksir dengan membandingkannya terhadap tangga DNA, yaitu potongan yang ukurannya diketahui, pada gel yang sama. Agarosa adalah polisakarida dari rumput laut. Jarak gerak kira-kira berbanding lurus dengan logaritma ukuran di dalam rentang tangga, sehingga ukuran ditaksir dengan interpolasi pada skala log.

DNA diwarnai, misalnya dengan etidium bromida yang tampak di bawah sinar ultraviolet; zat ini berpotensi karsinogen, dan pewarna yang lebih aman kini tersedia. Elektroforesis gel medan berdenyut (pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) adalah variasi elektroforesis yang berkala membalik arah medan listrik agar potongan DNA yang sangat besar, seperti kromosom, dapat terpisah.

RFLP (restriction fragment length polymorphism) adalah varian genetik yang terlihat dari perbedaan jumlah atau ukuran potongan DNA setelah dipotong enzim restriksi. Ahli epidemiologi memakai analisis RFLP untuk melacak dan mengenali sumber mikroba dalam wabah keracunan pangan. Satu contoh klinis memakai cara serupa: galur Clostridioides difficile seorang pasien dikenali sebagai ribotipe 27 dengan menggandakan daerah antara gen 16S dan 23S rRNA, memotongnya, lalu membandingkan pola pitanya di gel.

Sekuensing DNA: Sanger dan generasi berikutnya

Sekuensing Sanger (Sanger DNA sequencing, chain termination method) adalah teknik sekuensing yang memakai dideoksinukleotida bertanda untuk menghentikan pemanjangan rantai, lalu memisahkan potongan berbagai panjang dengan elektroforesis untuk membaca urutan. Dideoksinukleotida tidak mempunyai gugus 3ʹ-OH, sehingga rantai berhenti bila molekul ini terpasang. Dahulu dibuat empat reaksi terpisah dengan penanda fosfor radioaktif; kini keempat dideoksinukleotida diberi pewarna fluoresen berbeda dalam satu reaksi, dipisahkan dengan elektroforesis kapiler, dan dibaca pemindai laser. Fred Sanger mengembangkannya pada 1970-an dan menerima Hadiah Nobel Kimia 1980 untuk karya sekuensingnya.

Sekuensing generasi berikutnya (next generation sequencing) adalah kelompok teknik otomatis untuk sekuensing DNA yang cepat. Teknik ini dipakai laboratorium sejak 2005 dan menghasilkan urutan ratusan ribu sampai jutaan potongan pendek dalam sehari, masing-masing 25 sampai 600 pasang basa. Perangkat lunak menyusun potongan yang saling tumpang tindih menjadi urutan panjang yang disebut contig, seperti menyusun kembali beberapa salinan foto yang disobek. Urutan yang diterbitkan disimpan di GenBank, basis data publik milik National Center for Biotechnology Information.

Sekuensing genom utuh dan pelacakan wabah pangan

Sekuensing genom utuh (whole-genome sequencing) adalah proses menentukan seluruh urutan DNA suatu genom. Genom E. coli K12 sudah tersedia pada 1997. Genomika mikroba juga dipakai di forensik: publikasi pertama pada 2001 menunjukkan bahwa pengirim surat antraks di AS memakai satu galur yang sama untuk semua kiriman.

Di Amerika Serikat, PulseNet adalah jejaring laboratorium kesehatan masyarakat untuk mendeteksi dan melacak penyakit bawaan makanan. Menurut CDC, selama sekitar dua dekade jejaring ini memakai sidik DNA dengan PFGE, lalu beralih ke sekuensing genom utuh karena metode ini memberi sidik DNA yang jauh lebih rinci.

Garis waktu PulseNet mencatat pemakaian pertama sekuensing genom utuh untuk wabah pada 2010 dan untuk Listeria pada 2013. CDC memberi contoh wabah Salmonella 2018 yang dikaitkan dengan daging sapi giling: kasus-kasusnya berpola PFGE sama, tetapi sekuensing genom utuh menunjukkan tidak semuanya benar-benar cocok dengan daging itu. Semua data ini data AS.

Jejaring dan lembaga di Indonesia yang memakai sekuensing genom utuh untuk wabah pangan belum dapat dipastikan dari sumber resmi per 22 Oktober 2026; pelaporan dugaan wabah di Indonesia dibahas di Bab 19 tentang epidemiologi wabah. Genom yang hampir identik menunjukkan kemungkinan sumber bersama, tetapi jalur penularannya tetap dibuktikan dengan wawancara kasus, catatan pembelian, suhu, dan pembersihan, seperti contoh wabah di Bab 19.

Metagenomika (metagenomics) adalah kajian genom kolektif banyak spesies yang hidup bersama dalam satu relung lingkungan. Cara ini memungkinkan kajian mikroba yang sulit atau tidak dapat dibiakkan.

Batas uji molekuler

Mendeteksi urutan, bukan sel hidup. PCR menggandakan DNA tanpa memerlukan sel, sedangkan hitungan cawan di Bab 15 tentang menghitung mikroba hanya menghitung sel yang tumbuh. DNA dari sel mati yang belum terurai tetap dapat tergandakan, sehingga hasil positif setelah pembersihan atau pemanasan tidak membuktikan ada kuman hidup (Contoh 6). Menurut CDC, hasil uji molekuler influenza yang positif tidak selalu berarti virus infektif ada atau pasien menular.

Nilai Ct bukan ukuran daya tular. Artikel jurnal CDC menyatakan nilai Ct yang tepat untuk SARS-CoV-2 infektif belum diketahui, dan virus infektif pernah diisolasi dari sampel ber-Ct 34. Laporan MMWR dari San Francisco Bay Area menyimpulkan nilai Ct kemungkinan bukan pengganti yang andal dan konsisten untuk daya tular di antara varian.

Kontaminasi silang memberi positif palsu. Positif palsu (false positive) adalah hasil uji positif, termasuk untuk asam nukleat, padahal infeksi atau keadaan yang dicari tidak ada. Karena penggandaan berlipat, sedikit DNA hasil reaksi lain yang terpercik ke sampel dapat menggeser Ct belasan siklus lebih awal (Latihan 3). Sekuensing genom Neanderthal memerlukan penyiapan sampel yang sangat cermat karena pencemaran mikroba yang berat.

Negatif juga dapat keliru. Dalam satu contoh klinis, biakan dan uji toksin C. difficile negatif tetapi qPCR gen toksin B positif; dalam contoh lain, biakan Listeria negatif tidak dianggap cukup untuk menyingkirkan infeksi, sehingga uji amplifikasi asam nukleat dijalankan. Primer hanya menemukan sasaran yang dirancang untuknya, sehingga patogen lain tidak terdeteksi. Peluang hasil benar bergantung juga pada prevalensi, seperti dijelaskan di Bab 27 tentang nilai duga.

Membaca laporan uji molekuler

1. Sasaran dan metode: organisme atau gen apa, dan apakah PCR, RT-PCR, qPCR, atau sekuensing genom utuh.
2. Sampel: jenis, tempat, jam pengambilan, dan apakah sebelum atau sesudah pembersihan.
3. Bentuk hasil: positif atau negatif, nilai Ct, atau salinan per volume; Ct hanya dibandingkan di dalam satu laboratorium dan metode.
4. Kontrol: laporan yang baik menyebut kontrol positif dan negatif reaksi.
5. Biakan pendamping: hasil biakan menjawab ada atau tidaknya sel hidup, seperti di Bab 15 tentang menghitung mikroba.
6. Pembanding genom: hasil sekuensing genom utuh dibaca bersama data epidemiologi, bukan sendirian.
7. Pemutus: kesimpulan tentang sumber dan tindakan ditetapkan laboratorium dan dinas kesehatan.

Contoh kerja

Angka dalam contoh di bawah adalah angka latihan, kecuali disebut asalnya.

Contoh 1: efisiensi 90 persen. Dengan $E = 0{,}90$, satu salinan setelah 30 siklus menjadi $1{,}9^{30} \approx 2{,}3 \times 10^{8}$. Hasilnya hanya $0{,}21$ kali hasil ideal $2^{30}$, atau sekitar 4,7 kali lebih sedikit, walaupun efisiensi per siklus hanya turun 10 persen.

Contoh 2: dari jumlah awal ke Ct. Misalkan fluoresensi melewati ambang pada $10^{10}$ salinan dan $E = 1$. Sampel dengan 10 salinan awal mencapai ambang pada $n = \log_2(10^{10}/10) \approx 29{,}9$ siklus, dan sampel dengan 1.000 salinan pada $\log_2(10^{7}) \approx 23{,}3$ siklus. Sasaran 100 kali lebih banyak memberi Ct sekitar 6,6 siklus lebih awal.

Contoh 3: efisiensi dari kurva standar. Kemiringan $s = -3{,}32$ memberi $E = 10^{1/3{,}32} - 1 \approx 1{,}00$, atau 100 persen; $s = -3{,}6$ memberi $E \approx 0{,}90$. Kemiringan $-3{,}1$ memberi $E \approx 1{,}10$, lebih dari 100 persen, yang lazim dibaca sebagai tanda masalah reaksi atau pengenceran.

Contoh 4: menaksir salinan awal. Kurva standar sebuah laboratorium adalah $Ct = 38{,}0 - 3{,}32 \log_{10} N_0$. Sampel ber-Ct 31,4 memberi $\log_{10} N_0 = (38{,}0 - 31{,}4)/3{,}32 \approx 1{,}99$, sehingga $N_0 \approx 97$ salinan per reaksi. Angka ini jumlah salinan DNA sasaran, bukan jumlah sel hidup.

Contoh 5: kedalaman baca sekuensing genom utuh. Genom E. coli berukuran 4,6 juta pasang basa. Bila alat menghasilkan 1,5 juta bacaan sepanjang 150 bp, di dalam rentang panjang potongan sekuensing generasi berikutnya, jumlah basanya $1{,}5 \times 10^{6} \times 150 = 2{,}25 \times 10^{8}$, sehingga setiap basa rata-rata terbaca $2{,}25 \times 10^{8}/4{,}6 \times 10^{6} \approx 49$ kali.

Contoh 6: kasus pembuka, DNA mati dan Ct 37. Pembersihan dan sanitasi menurunkan sel hidup di talenan 4 log, dari $10^{6}$ menjadi $10^{2}$, seperti cara membaca reduksi log di Bab 3 tentang kinetika kematian mikroba. Bila DNA sel mati masih utuh, jumlah salinan sasaran hampir tidak berubah, sehingga Ct bergeser $\log_2 1 = 0$ siklus, padahal sel hidup turun 10.000 kali. Bila 90 persen DNA terurai, Ct hanya naik $\log_2 10 \approx 3{,}3$ siklus. Ct 37 dengan biakan negatif cocok dengan sisa DNA dari sel mati atau jumlah yang sangat sedikit, sehingga hasil itu sendiri tidak membuktikan talenan sumber wabah atau pembersihan gagal.

Kondisi berhenti

Hentikan dan serahkan kepada laboratorium, tim pencegahan infeksi, dokter, atau dinas kesehatan bila:

1. Teknisi atau manajer diminta menetapkan sumber wabah, atau menyatakan alat dan pangan aman, hanya dari satu hasil PCR atau sekuensing.
2. Teknisi diminta mengambil sampel klinis atau sampel untuk uji molekuler tanpa pelatihan, wadah, dan formulir serah terima dari petugas.
3. Peralatan, bahan, atau sisa makanan yang sedang diselidiki diminta dibersihkan, dibuang, atau diganti sebelum petugas selesai mengambil sampel; cara menjaga bukti ada di Bab 20.
4. Ada pekerjaan perbaikan di ruang laboratorium PCR, terutama ruang sesudah penggandaan, tanpa izin dan pengarahan petugas laboratorium.
5. Laporan tidak menyebut sasaran, metode, jenis sampel, atau kontrol; minta penjelasan laboratorium sebelum hasil dipakai.
6. Hasil uji dipakai untuk menuduh atau menghukum pekerja tertentu; data kesehatan pekerja dan keputusan kerja ada pada dokter dan pengelola menurut prosedur.
7. Ada pekerja atau tamu dengan gejala; arahkan kepada dokter dan fasilitas kesehatan, tanpa menafsirkan hasil ujinya sendiri.

Salah tafsir yang sering terjadi

Hubungan dengan bab lain

Bab 15 tentang menghitung mikroba menjelaskan hitungan sel hidup yang melengkapi uji molekuler, Bab 19 tentang epidemiologi wabah memakai hasil laboratorium dalam penyelidikan wabah, dan Bab 20 tentang patogen bawaan makanan membahas patogen pangan serta menjaga bukti. Bab 27 tentang uji diagnostik imunologi memberi sensitivitas, spesifisitas, dan nilai duga, Bab 10 · Data & Pengukuran tentang peluang untuk teknisi memberi peluang bersyarat, Bab 29 tentang DNA dan gen memberi struktur dan replikasi DNA, Bab 31 tentang rekayasa genetika memberi enzim restriksi dan kloning, Bab 18 tentang virus memberi RT-qPCR untuk norovirus, dan Bab 3 tentang kinetika kematian mikroba memberi reduksi log.

Latihan dan pembahasan

Referensi